Vývoj qPCR metod pro molekulární detekci veterinárních patogenů

Vývoj a validace RT-qPCR metody pro univerzální detekci cirkovirů u papoušků

Papouščí cirkovirus (psittacine beak and father disease virus, PBFDV,) je závažná virová nákaza především mladých papoušků, která představuje významnou hrozbu pro všechny chovatele exotického ptactva, včetně zoologických zahrad. Rychlé vyšetření je klíčovým faktorem pro včasnou detekci a zabránění šíření této nebezpečné nákazy. Význam viru PBFDV kontrastoval z dlouholeté absence qPCR detekční metody. Ve snaze zrychlit detekci viru PBFDV naše laboratoř vyvinula a validovala první qPCR metodu s využitím hydrolyzační sondy (TaqMan qPCR) pro univerzální detekci viru BFDV.

Černíková L., Vitásková E., Nagy A. (2017) Development and evaluation of TaqMan real-time PCR assay for detection of beak and feather disease virus. J Virol Methods. 2017 Jun;244:55-60. doi: 10.1016/j.jviromet.2017.02.017. Epub 2017 Mar 2.

Vývoj a validace RT-qPCR metody pro univerzální detekci viru chřipky A

Extrémní genetická variabilita viru chřipky A představuje zásadní problém v molekulární detekci tohoto nebezpečného humánního i veterinárního patogenu. Kontinuální evoluce ve druhově specifických liniích a vysoká genetická proměnlivost detekci viru chřipky A zásadním způsobem ztěžují. Následkem je nutnost modifikace stávajících metod, eventuálně zavádění nových metod. Z uvedeného důvodu RT-qPCR metody jsou navrženy na detekci viru chřipky A u jednotlivých hostitelských kategorií, například pro aviární influenzu, sezónní chřipku A u lidí, detekci chřipky u prasat nebo koní. Metody jsou odlišné a často se doporučuje několik metod pro detekci chřipky A i u daného hostitele. 

Naším cílem bylo uplatnit holistický přístup a navrhnout metodu na univerzální detekci viru chřipky A bez ohledu na hostitelský původ. Výslední „One Health“ RT-qPCR technika představuje v současnosti jednu z doporučených metod Evropské referenční laboratoře.

Nagy A, Černíková L, Kunteová K, Dirbáková Z, Thomas SS, Slomka MJ, Dán Á, Varga T, Máté M, Jiřincová H, Brown IH. A universal RT-qPCR assay for "One Health" detection of influenza A viruses. PLoS One. 2021 Jan 20;16(1):e0244669. doi: 10.1371/journal.pone.0244669.

Nagy A, Jiřinec T, Jiřincová H, Černíková L, Havlíčková M. (2019) In silico re-assessment of a diagnostic RT-qPCR assay for universal detection of Influenza A viruses. Sci Rep. 2019 Feb 7;9(1):1630. doi: 10.1038/s41598-018-37869-w.

Nagy A, Černíková L, Vitásková E, Křivda V, Dán Á, Dirbáková Z, Jiřincová H, Procházka B, Sedlák K, Havlíčková M. (2016) MeltMan: Optimization, Evaluation, and Universal Application of a qPCR System Integrating the TaqMan qPCR and Melting Analysis into a Single Assay. PLoS One. 2016 Mar 31;11(3):e0151204. doi: 10.1371/journal.pone.0151204. eCollection 2016. Erratum in: PLoS.

Nagy A, Vostinakova V, Pirchanova Z, Cernikova L, Dirbakova Z, Mojzis M, Jirincova H, Havlickova M, Dan A, Ursu K, Vilcek S, Hornickova J. (2010) Development and evaluation of a one-step real-time RT-PCR assay for universal detection of influenza A viruses from avian and mammal species. Arch Virol. 2010 May;155(5):665-73. doi: 10.1007/s00705-010-0636-x. Epub 2010 Mar 13.

Inovativní přístupy v navrhování qPCR metod

Základním omezením v navrhování qPCR metod pro detekci virů je jejich vysoká genetická variabilita. V odborných publikacích níže jsme navrhli přístupy, jak tento nepříznivý jev limitovat a to robustní sekvenční analýzou pro zjištění evolučně konzervativních, nebo semikonzervativních oblastí, zavedení další sondy do reakce qPCR, nebo integrace výhod dvou základních modifikací qPCR a to sekvenčně nespecifické a sekvenčně specifické detekce do jediné metody.

Nagy A, Černíková L, Vitásková E, Křivda V, Dán Á, Dirbáková Z, Jiřincová H, Procházka B, Sedlák K, Havlíčková M. MeltMan: Optimization, Evaluation, and Universal Application of a qPCR System Integrating the TaqMan qPCR and Melting Analysis into a Single Assay. PLoS One. 2018 Apr 23;13(4):e0196444. doi: 10.1371/journal.pone.0196444.

Nagy A, Vitásková E, Černíková L, Křivda V, Jiřincová H, Sedlák K, Horníčková J, Havlíčková M. Evaluation of TaqMan qPCR System Integrating Two Identically Labelled Hydrolysis Probes in Single Assay. Sci Rep. 2017 Jan 25;7:41392. doi: 10.1038/srep41392.

Nagy A, Jiřinec T, Černíková L, Jiřincová H, Havlíčková M. Large-scale nucleotide sequence alignment and sequence variability assessment to identify the evolutionarily highly conserved regions for universal screening PCR assay design: an example of influenza A virus. Methods Mol Biol. 2015;1275:57-72. doi: 10.1007/978-1-4939-2365-6_4

Alignment Explorer